精子畸形試驗報告中科院上海分院權(quán)威出具
黃工：13764818040
地址：上海市江場西路395號
1  范圍
 本規(guī)范規(guī)定了動物精子畸形試驗的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測。 
 2  引用標準
 GB 14924  試驗動物與飼料標準
 GB 15193?94  食品安全性毒理學評價程序  3  定義
 精子畸形 （sperm  malformation） 指精子形態(tài)的異常改變。 
 4  原理
 已知精子畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。常染色體和Y-性連鎖基因突變及某些染色體重排，如性-常染色體易位，也可使精子發(fā)生畸形。
 小鼠精子畸形試驗能評價受試物對精子生成、發(fā)育的影響，可檢測受試物在體內(nèi)對生殖細胞的遺傳毒性作用。
 
 5  試驗的基本原則
     通過適當?shù)耐緩绞箘游锝佑|受試物，經(jīng)過一定時間后處死動物，取其附睪，制備涂片，經(jīng)固定、染色，在顯微鏡下計數(shù)畸形精子。 
 6  儀器和器械
 生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、表面皿、離心管、小漏斗、吸管、滴管、載玻片、擦鏡紙等。  7
 試劑
 7.1  1%伊紅染色液
 稱取伊紅1g溶于100mL蒸餾水中。 7.2  生理鹽水、甲醇（A.R）  
 8  實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境
 常規(guī)使用動物是雄性小鼠。6周~8周齡，體重為30g ~35g。 實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。 
 9  劑量分組
 受試物至少設三個劑量組。分別取1/2、1/5、1/10或1/20LD50劑量。當受試物的LD50大于5g/kg體重時，可取5g/kg體重為高劑量。另外設陰性（溶劑）對照組和陽性物對照組。常用溶劑為水、生理鹽水、植物油（玉米油、花生油）等。陽性物對照組可采用環(huán)磷酰胺40mg/kg/
 每組至少有5只存活動物。 
 10  染毒途徑和方式
     染毒途徑視實驗目的而定。常用途徑為經(jīng)口灌胃方式。受試物各劑量組、陰性對照組和陽性物對照組的動物，均連續(xù)染毒5d，每日一次。一般于首次染毒后的第35d處死動物。 
 11  試驗方法 11.1  制片
 用頸椎脫臼法處死小鼠，剖開腹腔，暴露睪丸，分離兩側(cè)附睪，用眼科剪剖開附睪組織，與適量生理鹽水混勻，涂片。 11.2  固定
 待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。 11.3  染色
 將涂片于1%伊紅染液中染色1h，然后用蒸餾水輕輕沖洗，晾干。 11.4  觀察與計數(shù)
 首先，在低倍鏡下選擇背景清晰、精子分布均勻、重疊較少的區(qū)域，然后，在高倍鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整的1000個精子，計數(shù)其中畸形的精子。精子畸形主要表現(xiàn)在頭部。按Wyrobeks的分類標準，主要類型有：無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、尾折疊、雙頭及雙尾。無尾精子、頭部重疊的或整個與另一個重疊的精子均不計數(shù)。判斷雙頭、雙尾精子時，要注意與兩條精子的部分重疊相區(qū)別。 
 12  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
 每只動物應按精子畸形類型分別記錄，以便計算各實驗組的精子畸形發(fā)生率和精子畸形類型的構(gòu)成比。
 利用Wilcoxon秩和檢驗法和其他適當?shù)慕y(tǒng)計學方法。將受試物各劑量組精子畸形發(fā)生率分別與陰性對照組進行比較。
 精子畸形試驗陽性的判斷標準是畸形發(fā)生率至少為陰性對照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異，并存在劑量-反應關(guān)系者。
 一般正常小鼠的精子畸形率為0.8%~3.4%，但每個實驗室應有自己穩(wěn)定的精子自發(fā)畸形率。  13  試驗報告
 試驗報告應包括以下內(nèi)容：
 （1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用溶劑；
 （2）動物種屬和品系、體重、數(shù)量、來源（注明合格證號和動物級別）；
 （3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物室合格證號； （4）劑量分組，染毒途徑和方式；
 （5）試驗方法：簡述操作步驟，所用統(tǒng)計學方法；
 （6）結(jié)果：以列表方式報告受試物對動物精子畸形發(fā)生率和精子畸形類型分析的結(jié)果          （表1和表2）； （7）結(jié)論。
 涉及地區(qū)：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內(nèi)蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省